尊龙凯时细胞培养指南

培养条件

气相条件为95%空气与5%二氧化碳，温度设置在37℃。

传代方法

第一次建议进行1:2传代，传代后每两天更换培养液。建议同时购买细胞，以获得更多优惠。

在收到细胞后，应先进行处理，培养至良好状态，然后灌满完全培养液并封好瓶口，以确保运输过程中的细胞存活率。

开瓶后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒，并将其放入超净台中进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃及5% CO2的培养箱中，静置3-4小时以稳定细胞状态，之后再进行后续操作。

显微镜观察

在显微镜下观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议40x、100x和200x各一张）。前三天的观察照片是重要的售后依据，若未提供照片，默认细胞状态良好。

细胞培养步骤

a. 细胞传代

如果细胞汇合度未超过80%，需将瓶内的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2的孵箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，并用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞变圆情况，若细胞大部分脱落，迅速轻轻敲击培养瓶并添加超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后，吸出细胞悬液，转移至15ml的离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后将其放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 悬浮细胞传代步骤

1. 半换液法：将培养瓶竖着放置于培养箱中静置约1小时，轻轻吸出3ml培养基后，再补充3ml完全培养基。如果培养基颜色变化缓慢，可以直接添加约500ul的FBS；在传代时可直接添加5ml培养基分两瓶培养，通常在执行3次后可进行离心去除死细胞。

2. 离心换液法：如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，在1000 RPM离心5分钟，弃去上清后，补加1-2ml培养液重悬混匀，然后根据比例将细胞悬液分至新T25瓶，并添加6-8ml新配置的完全培养基以保持细胞活力，后续传代按1:2至1:5比例进行。

c. 细胞冻存

1. 当细胞生长至培养瓶的80%覆盖面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS洗涤细胞一次；
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，倒置在显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后转移悬液至15ml的离心管中，1000 RPM离心5分钟；
3. 弃去上清，沉淀细胞，再加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），充分混匀后转入冻存管。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若需转入液氮罐中，需在-80℃中存放24小时以上再进行转移。

d. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速将其置于37℃水浴解冻，直至无结晶后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟；
3. 弃去上清，沉淀细胞用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；
4. 第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

注意事项

有些细胞对基质的附着力不强，运输过程中可能出现细胞脱落的情况，这是正常现象。如脱落的细胞较多，可将培养瓶中的所有培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清进行临时培养。沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再一次离心，去掉上清后，加1-2ml完全培养基重悬。之后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养。