01 dsRNA是mRNA原液质量控制的关键必检项

mRNA疫苗是一种利用信使RNA（mRNA）分子副本产生免疫反应的疫苗。该疫苗由脂质纳米颗粒及封装在其中的RNA共同组成，以保护RNA链并帮助其进入细胞。由于新冠疫情的影响，mRNA疫苗因其在疗效、研发速度、成本、生产可拓展性和安全性等方面的显著优势而备受关注。mRNA原液的制备与转录是疫苗生产的关键步骤，mRNA的质量直接影响疫苗的临床效果。根据CDE发布的相关技术指导原则，必须控制mRNA相关杂质含量，包括5'非帽化RNA、双链RNA（dsRNA）、长链RNA和截短RNA等。双链RNA（dsRNA）作为一种重要的杂质，其来源于IVT过程中T7RNA聚合酶可能以RNA或DNA为模板进行转录，形成不同类型的dsRNA副产物，例如runoff转录本和流产转录本之间的互补配对等。

在细胞内，包裹mRNA的纳米脂质颗粒（LNP）通过细胞吞噬作用与内体融合，在内体的酸性环境中释放mRNA，进而启动翻译。在这一过程中，内体膜上的TLR3识别mRNA中的dsRNA杂质并激活信号转导通路，最终导致包括I型干扰素（IFN）在内的促炎性细胞因子的分泌。而进入细胞质中的dsRNA则主要通过RIG-1和MDA5进行识别，进一步上调干扰素的表达。由于TLR3、RIG-1及MDA5具有不同的RNA识别特异性，因此dsRNA会对mRNA的翻译效率产生不利影响，并可能导致药物效力的降低。因此，在mRNA疫苗的生产过程中，严格控制dsRNA的含量至关重要，这需要生产厂家对dsRNA进行精准定量检测。

02 ELISA法更适合用于dsRNA定量检测

目前用于dsRNA检测的方法包括dot blot（免疫斑点）、ELISA（酶联免疫吸附实验）、HTRF（均相时间分辨荧光）和HPLC。根据USP《Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality (Draft Guidelines)》的推荐，dot blot和ELISA是较为理想的dsRNA检测方法。HPLC方法可能存在分辨率和准确度不足的问题，而dot blot法操作简单，但灵敏度较低。目前，ELISA法与HTRF法已开发成为商用试剂盒，前者以体外抗原-抗体反应和酶催化相结合的方法，灵敏度可达到pg/mL水平，是医学实验和生物制药领域广泛应用的免疫分析方法。该方法通过双抗体夹心结构实现，颜色深浅与待测物浓度成正相关。

在试剂盒的开发中，dsRNA标准品的制备和选择是关键问题。虽然某些国外ELISA试剂盒使用poly I:C作为标准品，由于抗体对poly I:C和dsRNA的不同识别响应，可能导致dsRNA定量不准确。因此，需要自主制备序列随机、高纯度的dsRNA标准品。此外，引入化学修饰核苷酸可有效降低mRNA的自免疫原性，这也是卡塔琳·考里科和德鲁·韦斯曼获得2023年诺贝尔生理医学奖的原因之一。通过优化抗体选择和浓度组合，可以最大限度地减少序列和长度对测量结果的影响，在dsRNA的定量检测中，开发基于不同修饰类型标准品的dsRNA ELISA试剂盒，具有稳定、准确和灵敏的优势，可以满足mRNA领域大规模生产和技术迭代的需求。

尊龙凯时致力于提供高质量的生物医疗解决方案，确保在mRNA疫苗研发中对dsRNA的精准检测。